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微生物菌种冻干机:厌氧菌冷冻干燥管的制备

2018-10-23

微生物菌种冻干机:厌氧菌冷冻干燥管的制备


    真空冻干机是在抽真空的状态下让物质在低温下干燥的设备,主要用于微生物制剂和生物活性物质的干燥。菌种保藏室用来对微生物进行真空冻干保藏。微生物冷冻干燥法是长期保藏菌种的较好方法之一。因其便于批量生产、长期保藏成活力高,保藏和运输设备简单而成为一种普遍使用的保藏方法,已广泛应用于保存大部分细菌、真菌和一些病毒。


1.安瓿管准备

    安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时,先用2%盐酸浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用蒸馏水浸泡至pH中性,干燥后、贴上标签,标上菌号及时间,加入脱脂棉塞后,121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。


2.保护剂的选择和准备

    保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度及pH值,以及灭菌方法。如血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2-3次,每次10-30分钟,备用。


3.冻干样品的准备

    在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行)),与保护剂混合均匀,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例,为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与保护剂混匀,再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。


4.预冻

    一般预冻2小时以上,温度达到-20℃到-35℃左右。


5.冷冻干燥

    采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内,开始冷冻干燥,时间一般为8-20小时。

终止干燥时间应根据下列情况判断:

—— 安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状

—— 真空度接近空载时的最高值

—— 样品温度与管外温度接近

—— 选用1-2支对照管,其水份与菌悬液同量,视为干燥完结

—— 选用一个安瓿管,装1-2%氯化钴,如变深兰色,可视为干燥完结

冷冻干燥完毕后,取出样品安瓿管置于干燥器内,备用。


6.真空封口及真空检验

    将安瓿管颈部用强火焰拉细,然后采用真空泵抽真空,在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。

熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。


7.保藏

    安瓿管应低温避光保藏。


8.质量检查

    冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查,如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。


9.冷冻干燥法适用范围

    适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的保藏,但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。


10.保藏周期

    不同微生物复苏周期不同,一般10年左右。


11.复苏方法

—— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,

—— 将安瓿管顶部烧热,

—— 用无菌棉签沾冷水,在顶部擦一圈,顶部出现裂纹,用挫刀或镊子颈部轻叩一下,敲下已开裂的安瓿管的顶端,

—— 用无菌水或培养液溶解菌块,使用无菌吸管移入新鲜培养基上,进行适温培养。


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